تبلیغات
مقالات مهندسی پزشکی ، برق ، الکترونیک ،علوم پایه ، علوم آزمایشگاهی ، پزشکی،روانشناسی - الایزا ریدر

الایزا ریدر

1392/03/16 08:56

نویسنده : شهرام قاسمی
ارسال شده در: پزشکی ، دارو شناسی ، گیاه شناسی ، دانستنیهای پزشکی ، تجهیزات پزشکی ، بیوشیمی ،

الایزا ریدر  یا خوانشگر الایزاكه به اسامی <میكروپلیت ریدر> و <خوانشگر میكروپلیت فتومتریك> نیز معروف است، یك اسپكتروفتومتر تخصصی بوده كه به منظور قرائت نتایج تست الیزا طراحی شده است. این وسیله به منظور تعیین حضور آنتی بادی ها یا آنتی‌ژن های اختصاصی در نمونه ها به كار می‌رود. این تكنیك بر اساس تشخیص یك آنتی‌ژن یا آنتی بادی ها روی یك سطح جامد به صورت مستقیم یا ثانویه به كمك آنتی بادی های نشاندار و ایجاد محصولاتی استوار است كه می‌توانند توسط اسپكتروفتومتر  خوانده شوند. واژه الایزا ELISA، اختصاری از كلمات Enzyme-Linked  Immuno  sorbent  Assay است. 

 

كاربرد میكروپلیت ریدر
مــیــكـــروپــلــیـــت ریــدر بــرای خــوانــدن نـتــایــج تست‌های الایزا مورد استفاده قرار می گیرد. این تـكـنـیــك كــاربــردی مـسـتـقـیــم در ایـمـنــولــوژی و سـرولـوژی دارد. از مـیـان كـاربـردهـای دیگر این وسیله به تایید حضور آنتی بادی ها یا آنتی‌ژن‌های یك عامل عفونی در یك ارگانیزم، آنتی بادی های یـك واكـسـن یـا اتـوآنـتـی بـادی هـا بـرای مـثال در آرتریت روماتوئید می توان اشاره كرد.

 

اصول كار
الایـزا ریـدر یـك اسپكتـروفتـومتـر اختصـاصی است. بر خلاف اسپكتروفتومترهای معمولی كه قرائت جذب نوری را در گستره وسیعی از طول موج ها تسهیل می كنند، الایزا ریدر دارای فیلترها یا گریتینگ های انكساری بوده كه گستره طول موج ها را محدود كرده و معمولا بین 400 تا 750 نانومتر  عمل می كنند. برخی از الایزا ریدرها در گستـره مـاوراء بنفـش عمـل كرده و قرائت را در مـحــدوده 340 تــا 700 نـانـومتـر انجـام مـی دهنـد. سـیـستم نوری موجود در این دستگاه ها توسط تعدادی از كارخانه ها با استفاده از فیبرهای نوری به منظور تامین نور جهت چاهك های حاوی نمونه در میكرو پلیت طراحی می شود. ابتدا یك شعاع نوری از نمونه ای كه دارای قطری بین 1 تا 3 میلی متر است عبور كرده و سپس یك سیستم آشكار كننده، نور عبوری از نمونه را آشكار و تقویت می كند. در مرحله بعد، سیگنال مربوط به جذب نوری نمونه‌ها ثبت شده و سیستم خوانشگر نیز آن را به اطلاعاتی تبدیل می كند كه سبب تفسیر نتایج تست می شوند. برخی از الایزا ریدرها با استفاده از سیستم های شعاعی نوری دوتایی كار می كنند.
نمونه های مورد آزمایش در پلیت هایی كه به این منظور طراحی شده اند و دارای تعداد خاصی چاهك هستند، قرار می گیرند. پلیت های 8 ستونی همراه با 12 ردیف كه در مجموع 96 چاهك را تشكیل می دهند، رایج تر از بقیه هستند. برای كاربردهای اختصاصی تر، تعداد چاهك ها افزایش می یابد كه در برخی موارد تا پلیت های 384 چاهكی را نیز شامل می شود. افزایش تعداد چاهك ها به منظور كاهش مقدار مصرف معرف ها و نمونه ها است. موقعیت سنسور نوری الایزا ریدر بر اساس نوع كارخانه سازنده متغییر است؛ به طوری كه در برخی موارد ممكن است در بالای پلیت حاوی نمونه و گاهی نیز مستقیما در زیر پلیت قرار گیرد. امروزه میكرو پلیت ریدرها دارای كنترل هایی هستند كه به وسیله میكروپروسسورها تنظیم شده اند.

وسایل لازم جهت انجام تكنیك الایزا  
جهت انجام آزمایش الایزا تجهیزات زیر مورد نیاز  است:
1- الایزا ریدر 
2- میكرو پلیت واشر (شستشو دهنده چاهك ها)
3- سیستم توزیع كننده مایع (كه در این مورد ممكن است از پیپت ها چند كاناله استفاده شود)
4- انكوباتور

تجهیزات مورد نیاز در انجام تست های الایزا
مراحل مكانیكی انجام تكنیك الایزا
یك تست الیزا به طور رایج شامل مراحل زیر است:
1- شستشوی اولیه پلیت كه ممكن است با استفاده از میكرو پلیت واشر انجام شود.
2- استفاده از یك توزیع كننده مایع (دیسپنسر) یا پی پت چند كاناله.
3- پلیت در انكوباتور قرار داده می شود كه دارای دمای كنترل شده بوده و واكنش ها در آن محل انجام می شوند.
بسته به نوع تست، مراحل 1، 2 و 3 ممكن است چـنـدین بار تكرار شوند، تا این كه معرف‌های اضافه شده، واكنش ها را كامل كنند.
سـرانـجـام، وقـتـی تـمـام مـراحـل انـكوباسیون كامل شد، پلیت به الایزا ریدر منتقل شده و سپس بـا قـرائـت جـذب نـوری نمونه ها، نتیجه آن ها مشخص می شود.


مراحل بیوشیمیایی تكنیك الیزا
1- چــــاهــــك هــــای مــــوجــــود در پــلــیــــت بــــا آنـتــی‌بــادی‌هــا و آنـتــی ژن هــا پــوشـیـده (Coat) می‌شوند.
2- نـمــونــه هـا، كـنـتـرل هـا و اسـتـانـداردهـا بـه چاهك‌ها اضافه شده و در دمای اتاق  یا 37 درجه سـانتیگـراد بـرای یـك مـدت زمـانی معین، طبق دستـورالعمـل تست انكوبه می شوند. در طول انكـوباسیون، بسته به حضور یا عدم حضور و مقدار آنتی ژن   یا آنتی بادی موجود در نمونه، آنتی ژن نمونه به آنتی بادی كوت شده به پلیت، یا آنتی بادی موجود در نمونه به آنتی ژن Coat شده در پلیت باند می شود.
3- پـــس از انـكـــوبـــاسـیـــون، آنـتـــی ژن‌هــا  یــا آنـتــی‌بــادی‌هــای آزاد، شـسـتشـو داده شـده و بـا اســتــفـــاده از مـیـكــرو پـلـیــت واشــر و یــك بــافــر شستشوی مناسب، برداشته می شوند.
4- در مرحله بعد، یك آنتی بادی ثانویه، به نام كونژوگه، اضافه شده كه حاوی آنزیمی است كه به منظور ایجاد یك تغییر رنگی، با یك سوبسترا واكنش خواهد داد.
5- ســـپــــس یــــك دوره زمــــانــــی ثــــانــــویــــه از انـكــوبــاسـیـون شـروع مـی شـود كـه در طـی آن، كـونـژوگـه بـا كمپلكس آنتی ژن- آنتی بادی در چاهك ها پیوند برقرار خواهد كرد.
6- پس از انكوباسیون، یك دوره شستشوی جدید انجام می شود كه سبب برداشت كونژوگه متصل نشده از چاهك ها خواهد شد.
7- در مرحله بعد، سوبسترا اضافه می شود. آنـزیـم بـا سـوبستـرا واكنش خواهد داد و سبب تغییر رنگ محلول خواهد شد. این واكنش نشان خواهد داد كه چه مقدار كمپلكس آنتی‌ژن- آنتی بادی در پایان تست وجود خواهد داشت. 
8- وقتی كه زمان انكوباسیون كامل می شود، یك معرف برای توقف واكنش آنزیم- سوبسترا به آن اضافه شده كه از تغییرات بیشتر در شدت رنگ ایجاد شده، جلوگیری می‌كند. این معرف عموما یك اسید رقیق است. 
9- در پایان، پلیت بوسیله الایزا ریدر خوانده می شود. نتایج حاصله برای تعیین مقادیر اختصاصی یا حضور آنتی ژن ها یا آنتی بادی ها در نمونه به كار برده می شوند.
تــوجـه: بـرخـی از چـاهـك هـا بـرای استـانـداردهـا و كنتـرل هـا استفـاده مـی شـونـد. استانداردها برای تعریف نقاط cut-off به كار برده می شوند. استانداردها و كنترل ها مـقـادیر معینی هستند و برای اندازه گیری نتایج تست و ارزیابی اطلاعات در مقابل غلظت‌های مشخصی برای هر كنترل به كار برده می شوند. فرایند توصیف شده در بالا عمومی است؛ اگرچه بسیاری از تست های الایزا وجود دارند كه همراه با مراحل یا متغیرهای اختصاصی هستند.

نصب تجهیزات 
به منظور عملكرد صحیح الایزا ریدر، نكات زیر لازم است تا رعایت شود:
1- یك محیط تمیز و عاری از گرد و غبار
2- یك میز كار ثابت و به دور از تجهیزاتی از قبیل سانتریفوژ، شیكر و ... كه سبب لرزش آن می شوند. این میز باید دارای اندازه مناسبی باشد  به طوری كه در كنار الایزا ریدر، فضای كاری مناسبی وجود داشته باشد. تجهیزات تكمیلی مورد نیاز برای انجام تكنیك توصیفی بالا عبارتند از: واشر، انكوباتور، دیسپنسر و كامپیوتر همراه با وسایل جانبی آن.
3- یك منبع تغذیه الكتریكی، كه سازگار با استانداردها و معیارهای كشور باشد. در كشورهای آمریكایی به طور مثال، عموما فركانس های 60 هرتز و 110 ولت استفاده می‌شود، در حالی كه در نواحی دیگر از جهان 220 تا 240 ولت و 50 تا 60 هرتز به كار برده می شود.

كالیبراسیون الایزا ریدر
كالیبراسیون الایزا ریدر، یك مرحله اختصاصی است كه باید توسط یك تكنسین یا مهندس آموزش دیده كه به دستورالعمل های سازنده دستگاه آشنایی دارد، انجام شود. بـرای انجـام كالیبراسیون، داشتن یك مجموعه از فیلترها كه از لحاظ اندازه، یكسان هستند، الزامی است. سازندگان این دستگاه ها، پلیت های كالیبراسیون را برای هر طول موجی كه دستگاه به كار می برد فراهم می كنند.
پلیت های كالیبراسیون مجهز به حداقل سه مقدار جذب نوری از قبل تعیین شده (پایین، متوسط و مقدار بالا)، در دامنه اندازه گیری هستند.
برای انجام كالیبراسیون مراحل زیر را باید دنبال كرد:
1- پلیت كالیبراسیون را روی دستگاه قرار دهید.
2- یـك خـوانـش كـامـل را بـا پلیـت كـالیبراسیون انجام دهید. مشخص كنید كه آیا تفاوت‌هایی در قرائت های به دست آمده از یك چاهك به چاهك دیگر وجود دارد یا خیر. چنانچه اختلافی مشاهده شد، پلیت را به اندازه 180 درجه چرخانده و قرائت را مجددا تكرار كنید تا    از اختلافاتی كه به خود پلیت نسبت داده می شوند، جلوگیری كنید. به طور كلی، اگر نتایج پلیت در دو طول موج، به میزانی باشد كه انتظار داریم، گفته می‌شود كه دستگاه به كالیبراسیون دیگری احتیاج ندارد.
3- تایید كنید آیا خوانشگر به كالیبراسیون احتیاج دارد یا خیر. چنانچه به كالیبراسیون احتیاج دارد، راهنمایی های  رایج كارخانه سازنده دستگاه را برای كالیبراسیون دنبال كنید. تایید كنید كه خطی بودن )linearity( خوانشگر تا حد امكان قابل قبول است.
4- اگــر دستگـاه حـاوی یـك پلیـت كـالیبـراسیـون نیسـت، یـك محلـول رنگـی را در چاهك‌های یك پلیت از آن ریخته و فوری نتایج را قرائت كنید. سپس پلیت را به اندازه 180 درجه چرخانده و دوباره قرائت را انجام دهید. اگر هر دو خوانش ها و میانگین مقادیر در هر ردیف یكسان هستند، خوانشگر كالیبر است.
5- تایید كنید كه خوانشگر به صورت ستون به ستون نیز كالیبر است. یك پلیت تمیز و خالی را  در محل مخصوص قرار دهید و قرائت را انجام دهید. اگر اختلافی بین هر یك از خوانش های میانگین از اولین تا آخرین ستون وجود ندارد، می توان فرض را بر این گذاشت كه خوانشگر كالیبر است.

حفظ و نگهداری رایج
‌نـگـهــداری اســاســی (تـكـرار بـه صـورت روزانه)
1- مـرور ایـنـكـه سنسورهای نوری هر كانال تـمـیـز هـسـتـنـد. چـنـانـچـه كـثـیـف هـستند، سطح پنجره‌‌های عبور دهنده نور و سنسورها را با یك برس كوچك تمیز كنید.
2- تایید كنید كه سیستم نوری تمیز  است.
3- تایید كنید كه كالیبراسیون خوانشگر كافی اسـت. وقـتـی كـارهـای روزانه شروع می شود، اجـازه دهـید تا خوانشگر برای مدت 30 دقیقه گرم شود. در مرحله بعد، قرائت Blank را انجام دهـیـد و سـپـس یـك پـلیت كامل از سوبسترا را قـرائـت كـنـیـد. خـوانـش هـا مـی بـایـست یكسان بـاشند. اگر این طور نبود، پلیت را چرخانده و قرائت را به منظور تعیین این كه آیا اختلاف در پلیت یا در خوانشگر است، تكرار كنید.
4- سـیـسـتــم كـشـنــده اتــومــاتـیــك اســلایــدهـا (Automatic drawer sliding system) را بــررسـی كنید كه باید نرم و ثابت باشد.

‌نـگـهـداری بـازدارنـده (تـكـرار هـر سه ماه یكبار)
1- پـــایـــداری لامـــپ را تـــایـیــد كـنـیــد. پـلـیــت كالیبراسیون را به كار برده، قرائت را با فاصله 30 دقیقه مجددا با همان پلیت انجام دهید. قرائت ها را مقایسه كنید كه هیچ تفاوتی نباید میان آن ها مشاهده شود.
2- سیستم نوری دتكتور و سیستم های نوری را تمیز كنید.
3- كشنده پلیت (Plate drawer) را تمیز كنید.
4- مكان قرار گیری هر چاهك را با استفاده از سـیـسـتـم هـای انتشار نور و آشكار  كننده تایید كنید

منابع
[1]  WHO. Maintenence manual for lavoratory equipment. 2008. 2nd Edition.
[2]  Fitzgerald A., Kingsley C. and Kusko A. Electric machinery. 1971.
[3]  Johns W.L. Selection of basic laboratory equipment for laboratories with limited resources. 2000.


روش كار

ست الایزا را در حالت معمول برای ردیابی آنتی ژن یا آنتی بادی بكار می برند بدین ترتیب كه یكی از این دو ماده در بستر جامد ثابت می شود و برای ردیابی دومی بكار گرفته می شود، اما اساسا برای ردیابی هر جفت ماده ای كه مثل جفت آنتی ژن و آنتی بادی به هم گرایش داشته و قدرت اتصال مناسبی نسبت به هم دارند میتواند بكار گرفته شود (مثلا لكتین به لیگاند مربوطه اش یا مولكول به گیرنده اختصاصی اش) البته این پدیده یعنی اتصال بین دو ماده ای كه آنتی بادی و آنتی ژن نیستند اما گرایش به هم دارند اغلب اوقات مشكل آفرین است و برای بالا بردن حساسیت و اختصاصیت اتصال بین آنتی بادی و آنتی ژن در الایزا باید این اتصالات ناخواسته را به طریقی مهار كرده و یا كارهای جبرانی لازم را در نظر گرفت. 1 ) تست الیزا برای جستجوی آنتی ژن: ELISA روش بسیار حساسی است که (معمولا) برای جستجوی آنتی ژن یا آنتی بادی بکار میرود در تحت شرایط تنظیم شده (از نظر غلظت یونی و pH) پروتئین ها (آنتی ژن یا آنتی بادی) به طور خودبخود تمایل دارند که به بستر جامد (در این تست plate هایی از جنس پلی استیرن) متصل شوند، ماهیت این اتصال بخوبی معلوم نشده است اما برگشت پذیر بوده و با استفاده از pH های بالاتر یا پایین تر و استفاده از غلظت های یونی بالا اتصال قطع میشود این نوع اتصال خودبخودی اگر چه ظرفیت محدودی دارد ولی با بكارگیری سیستم های تقویتی مناسبی مثل سیستم آنزیم-سوبسترا این اتصالات وسیله بسیار خوبی برای طراحی سیستم الایزا گردیده است. برای انجام الایزا: 1 ) ابتدا باید پروتئین مورد نظر را به كف پلیت چسباند. 2 ) نقاط اتصال باقی مانده را باید با محلول پروتئینی مناسب مسدود كرد. 3 ) محلول مورد آزمایش را اضافه كرد تا دو ماده همدیگر را پیدا كرده و متصل شوند 4 ) سیستم های تقویتی اولیه را برای افزایش حساسیت آزمایش بكار گرفت 5 ) سیستم آنزیمی نهایی را به راه انداخته و رنگ نهایی تولید شده را اندازه گرفت حال این 5 مرحله به تفكیك توضیح داده می شوند: 1 ) اتصال پروتئین به كف پلیت (Coating): آنتی ژن (یا آنتی بادی) در مقادیری در حدود میکروگرم به داخل چاهک پلیت الایزا اضافه شده و فرصت داده میشود تا به مقدار کافی به کف چاهك (well) متصل شود برای اینكار بسته به نوع پروتئین بافرهای مختلفی به كار گرفته می شود و غلظت پروتئین نیز باید مناسب سازی شود در مقادیر بسیار پایین حساسیت ردیابی پایین می آید و در مقادیر بالای آنتی ژن اتصالات سستی نیز برقرار میشود كه در مراحل بعدی كنده شده و هنگام شستشو آنتی ژن همراه با آنتی بادی اختصاصی دفع می شوند و لذا حساسیت تست مجددا پایین می آید. بطور كلی این مرحله اساسی بوده و نقش زیادی در نتیجه نهایی دارد ایده آل های مورد انتظار برای این مرحله اینها هستند: الف) مقدار آنتی ژن متصل شده به كف همه چاهك های یك پلیت باید یكنواخت باشند و كمترین واریانس را در نتیجه ایجاد كنند، بدین معنی كه وقتی یك نمونه واحد را در چند چاهك مختلف منتقل نموده و آزمایش كنیم باید نتایج بدست آمده به هم نزدیك بوده و حداقل خطا را نشان دهند. همچنین اگر آزمایش مورد نظر در حجم بالا انجام میگیرد و چند پلیت را هم زمان كوت نموده و استفاده میكنیم باید جنس پلیت ها و شركت تهیه كننده آنها یكسان باشد تا از خطای مربوط به تفاوت در قدرت اتصال پلیت ها جلوگیری شود و ترجیحا بافر كوتینگ و زمان كوتینگ و محلول آنتی ژنی آماده شده برای كوتینگ بهتر است یكسان باشند. ب) اتصالات برقرار شده بین آنتی ژن و بستر جامد باید به اندازه كافی محكم و قوی باشند تا در مراحل شستشوی بعدی كنده نشوند، معمولا برای آنتی ژن های عادی، اتصال دهنده اضافی لازم نیست ولی اگر آنتی ژنی استثنائاً با روش معمول به كف پلیت نچسبید یا اتصالات سستی برقرار كرد از مواد و روش های خاصی برای اتصال آنتی ژن به كف بستر استفاده می شود (مثلاً استفاده از گلوتارآلدئید یا اشعه ایكس یا ...). ج) پروتئین متصل شده نباید آنقدر كم باشد كه نتواند مقادیر بالای آنتی بادی را جذب كند در این صورت غلظت های بالای آنتی بادی قابل تشخیص نخواهد بود از طرفی پروتئین متصل شده نباید آنقدر زیاد باشد كه اتصالات غیراختصاصی از اتصالات اختصاصی بیشتر شوند كه در این صورت جواب آزمایش قابل اغتماد نخواهد بود برای تامین این سه هدف تمهیدات خاصی به كار گرفته می شوند كه در فرصتی مناسب توضیح داده خواهند شد 2 ) مرحله مسدود سازی یا بلوكینگ (blocking): نقاطی از كف پلیت كه با پروتئین اختصاصی پوشانده نشده اند با استفاده از محلول های پروتئینی خنثی (از این نظر كه در واكنش اختصاصی بعدی اثر سوئی ندارد) پوشانده می شوند محلول های پروتئینی برای این منظور حاوی شیر کم چربی یا آلبومین گاوی یا ژلاتین و یا کازئین میباشند. علاوه بر پروتئین از دترژانت های غیر یونی خاصی نظیر Tween 20 یا Tween 80 یا ... نیز به عنوان كمكی استفاده می شوند نوع این مواد و مقادیر بكار برده شده به صورت تجربی تعیین می شوند و با توجه به تجربیات دیگران می توان محدوده خاصی را برای كار مورد نظر امتحان كرد و بهترین غلظت را بدست آورد (چون پروتئین ها از ریشه های جانبی متفاوتی برخوردارند لذا برای پروتئین های بسیار خالص مثل پروتئین های ریكامبینانت مناسب سازی این تركیبات در بالا بردن اعتبار نتایج بسیار كمك كننده خواهد بود). علاوه بر پروتئین و دترژانت، غلظت یونی بافر بلوك كننده نیز اهمیت زیادی دارد و برای اتصال انتخابی پروتئین مورد نظر (از میان مخلوط پروتئینی) میتوان بافرهای مختلف و غلظت یونی متفاوت را ارزیابی كرده و بهترین بافر را برای آزمایش مورد نظر بدست آورد. 3 ) اتصال آنتی ژن و آنتی بادی محلول مورد آزمایش كه احتمال میرود حاوی مقادیر قابل ردیابی از آنتی بادی بر علیه آنتی ژن اختصاصی موجود در كف پلیت میباشد در این مرحله در بافر مناسبی تهیه شده و اضافه می شود آنتی بادی شناور در محلول، آنتی ژن متصل به بستر را پیدا كرده و به آن متصل می شود بندرت این آنتی بادی متصل به آنزیم است اما در اغلب اوقات كونژوگه آنزیمدار در مرحله بعدی بكار گرفته می شود. آنتی بادی های متصل نشده با عمل شستشو از محیط حذف می شوند بافر شستشو معمولا دارای پروتئین خنثی به كار گرفته شده در محلول بلوكان است. چرا؟ حاوی دترژانت میباشد. چرا؟ و از نظر قدرت و pH بافری مناسب برای اتصال آنتی ژن با آنتی بادی است. آنتی بادی ها، سرم ، و محلولهای بكار گرفته شده در مراحل مختلف الایزا معمولا در بافر شستشو رقیق می شوند. 4 ) سیستم های تقویتی اولیه سیستم تقویتی اولیه قبل از سیستم تقویتی اصلی (كه همانا بكار گرفتن خصوصیت آنزیمهاست) میباشد در این مرحله ما واكنش های اضافه تری را به كار میگیریم تا قدرت اندازه گیری تست (حساسیت و اختصاصیت) بالا برده شود. بدین منظور از قدرت تقویت كنندگی بیوتین-آویدین، بیوتین-استرپتاویدین، لكتین-لیگاند و ... استفاده می شود. 5 ) تقویت آنزیمی هر آنزیمی بر روی سوبسترای اختصاصی خود اثر كرده و آنرا به محصول تبدیل می كند این واكنش در طی زمان منجر به جمع شدن مقدار متنابهی از محصول در محیط می شود بدین معنی كه با گذشت زمان معینی یك مولكول آنزیم می تواند مولكول های سوبسترای بسیاری را به محصول تبدیل كند این اثر افزایشی در حقیقت اساس الایزا را تشكیل میدهد. بدین ترتیب كه آنتی بادی نهایی باقی مانده پس از شستشوی نهایی با مولكول آنزیم متصل است و افزودن سوبسترا در طی زمان معینی (مثلاً یك ساعت) منجر به آزاد سازی مقادیر متنابهی سوبسترا می گردد كه یا خود رنگی میباشد یا در واكنش با ماده دیگری (كروموژن یا رنگزا) كه به محیط اضافه شده است رنگ تولید میكند در نهایت رنگ تولید شده توسط دستگاه قرائت كننده مخصوصی خوانده شده و محاسبات لازم بر روی داده های بدست آمده انجام می گیرد اساس تست Sandwich ELISA برای اندازه گیری سیتوکین در روش الایزای ساندویچی مولكول اندازه گیری شده در واقع در بین دو مولكول مختلف آنتی بادی قرار میگیرد (ساندویچ میشود) مثلا این روش را در مورد اندازه گیری سایتوكاین اینترفرون گاما شرح میدهیم: اساس) سلول های طحالی گرفته شده از موش های دریافت کننده واکسن در اثر تحریک با آنتی ژن اختصاصی در محیط کشت تکثیر پیدا خواهند کرد برای تعیین اینکه غالب سلول های تکثیر یابنده از نوع Th1 هستند یا Th2 باید پروفیل سیتوکینی در محیط کشت مشخص شود بدین منظور تعیین مقدار سیتوکین های IL-4 و IFN-g ترشح شده توسط سلول ها در محیط کشت مد نظر قرار میگیرد. چنانكه در شكل زیر مشخص شده است در این روش آنتی بادی منوکلونال ضد آنتی ژن به کف plate چسبانده میشود سپس فرصت داده میشود تا آنتی ژن (در این تحقیق سیتوکین IL-4 و IFN-g ) به آن متصل شود در مرحله بعدی آنتی بادی پلی کلونال ضد آنتی ژن اضافه میشود که متصل به آنزیم پراكسیداز HRP است و اضافه شدن سوبسترا همراه با کروموژن منجر به ایجاد محصول رنگی میشود که توسط دستگاه ELISA Reader قرائت میگردد چون در این روش آنتی ژن در بین دو آنتی بادی قرار میگیرد لذا به ساندویچ مشهور شده است.



دیدگاه ها : نظرات
برچسب ها: الایزا ریدر ، سیستم الایزا ریدر ، طرز کارالایزا ریدر ، الایزا ریدر چگونه کار می کند ، ساختمان الایزا ریدر ، الایزا چیست ،
آخرین ویرایش: - -



Check Google Page Rank

تصویر ثابت